Bioprinted 3D vascularized tissue model for drug toxicity analysis

연구 배경

약물 시험용 3차원(3D) 조직 모델에는 영양분, 산소, 약물을 운반할 관류 혈관이 필요하며, 내피세포층이 있으면 약물이 혈관벽을 거쳐 조직에 도달하는 과정을 재현할 수 있습니다. 저자들은 기존 바이오프린팅 혈관 기법의 한계로 탄수화물 유리 섬유의 짧은 수명, 세포 함유 젤라틴 인쇄의 낮은 해상도와 1 cm보다 두꺼운 구조체에만 적용 가능한 점, 플루로닉 다층 방식의 복잡성과 많은 인쇄 재료 소모를 들었습니다.

설계와 접근

구조체는 저자 그룹이 앞서 개발한 희생 바이오프린팅 기법을 사용합니다. 유리 모세관 안에서 아가로스를 4 °C에 10초간 굳혀 섬유로 만들고, HepG2/C3A 세포를 담은 GelMA 전구체에 인쇄한 뒤 20초간 UV로 가교하고 손으로 섬유를 뽑아 매끄러운 채널을 남깁니다. 저자들은 100–1000 μm 범위의 채널을 재현성 있게 만들 수 있고, 희생 재료를 녹이는 공정이 필요 없으며, 내피세포 단층이 자라기 좋은 매끄러운 내면을 얻을 수 있다는 점을 이 방법의 장점으로 들었습니다. HepG2/C3A 세포는 일차 간세포보다 안정적인 인간 간세포 공급원이어서 선택했습니다. 아가로스 4%, 6%, 8%와 GelMA 5%, 8%, 10%를 비교해, 4%는 너무 무르고 8%는 너무 단단하다는 이유로 6% 아가로스를, 그리고 UV 20초 조건의 8% GelMA를 택했습니다. 채널에 HUVEC을 심어 48시간 배양한 뒤, 밀폐형 생물반응기에 넣어 채널로는 HUVEC 배지를 흘리고 하이드로젤 바깥은 HepG2/C3A 배지로 채웠습니다.

평가 방법

하이드로젤은 주사전자현미경으로 관찰했고, 40 nM 로다민 6G의 확산을 직경 100, 500, 1000 μm 채널에서 정적 조건과 50 μl/h 흐름 조건으로, 또 500 μm 채널에서 HUVEC층 유무에 따라 1, 15, 30분에 촬영했습니다. 내피세포층은 F-액틴·CD31 염색 후 공초점 현미경으로 확인했습니다. 약물 영향은 30 mM APAP를 채널로 48시간 관류하는 실험, 웰 플레이트의 HUVEC에 15·30 mM APAP를 24·48시간 처리하는 실험, HUVEC층이 있는 구조체의 생사 염색과 HUVEC층 유무에 따른 HepG2/C3A 구조체의 PrestoBlue 대사 활성 측정으로 평가했습니다. 모든 실험은 인간 세포를 사용한 체외 실험입니다.

연구 내용과 주요 결과

8% GelMA의 영률은 12.1 ± 1.1 kPa로, 건강한 인간 간에 대해 보고된 5.5 ± 1.6 kPa보다 높았습니다. 저자들은 이것이 적절한 세포 성장을 보인 가장 낮은 GelMA 농도와 UV 노출 조건이라고 밝혔습니다. 평균 기공 크기는 143.2 ± 6.4 μm였고, 염료는 정적 조건보다 흐름 조건에서 채널 전체로 더 빨리 확산되었습니다.

HUVEC은 100 μm 채널을 막았고 1000 μm 채널을 덮는 데는 최대 5일이 걸렸으나, 500 μm 채널은 48시간 뒤 고르게 덮었으며 채널 축을 따라 정렬하고 강한 CD31 신호를 보였습니다. 7일째에는 내피세포가 주변 GelMA로 침윤해 새싹을 형성했습니다. 내피세포층 유무와 관계없이 지지체의 기공률은 같았으므로, 저자들은 HUVEC층이 있을 때 염료 확산이 늦어진 것(p < 0.001)을 내피 장벽 자체의 효과로 해석했습니다.

30 mM APAP를 48시간 관류하자 내피세포층이 손상되어 F-액틴과 핵 염색이 불연속적으로 나타났고, 15 또는 30 mM APAP의 정적 처리에서도 모든 조건에서 HUVEC의 대사 활성이 감소해 손상이 흐름과 무관함을 보였습니다. 약물이 없을 때는 두께 약 3 mm 구조체의 두 영역 모두에서 세포 생존율이 80%를 넘었습니다. APAP를 가하면 세포 사멸이 채널 주변에 집중되어, 채널에서 약 300 μm 이내 영역의 생존율은 48시간 뒤 20%로 떨어졌고 약 600 μm 떨어진 영역은 영향이 적었으며, 채널 주변의 HepG2/C3A 세포는 HUVEC보다 더 많이 살아남았습니다.

30 mM APAP 처리 24시간과 48시간 뒤, HepG2/C3A만 있는 구조체는 HUVEC으로 덮인 채널을 가진 구조체보다 대사 활성이 낮았습니다. 저자들은 이를 내피세포층의 보호 효과로 해석하고, HUVEC이 장벽으로서 약물 확산을 늦추거나 약물 일부를 대사하거나 두 작용을 함께 하는 것으로 추정했습니다.

남은 과제

저자들은 이 모델을 초기 단계로 규정했습니다. GelMA는 건강한 간 조직보다 단단했으며, 인간 일차 간세포와 간 내피세포를 함께 배양하면 생체 조건을 더 잘 반영할 수 있을 것이라고 제안했습니다.

다른 연구와의 연결

저자들이 인용한 관련 Nature Materials 연구는 쥐 일차 간세포를 담은 하이드로젤에 탄수화물 유리 섬유를 인쇄한 뒤 녹여 혈관을 만들었고, 이 모델은 인쇄한 아가로스 섬유를 뽑아내 단일 내피화 채널을 만들고 이를 통해 내피세포층이 약물 전달과 독성을 어떻게 바꾸는지 평가했습니다.