Graphene Oxide Hierarchical Patterns for the Derivation of Electrophysiologically Functional Neuron-like Cells from Human Neural Stem Cells

연구 배경

배양 기판의 표면 지형은 인테그린 군집, 초점접착 형성, 세포골격 재배열을 거쳐 줄기세포의 운명을 조절할 수 있으며, 그래핀 기반 표면이 신경 분화를 촉진한다는 보고도 있습니다. 그러나 기존 지형 연구는 대부분 단순한 패턴을 사용했고, 분화된 세포가 전기생리학적으로 기능하는지는 평가하지 않았습니다. 저자들은 특정 크기의 계층적 GO 지형이 hNSC의 초점접착 신호를 강화하고 기능성 신경 유사 세포를 얻을 수 있는지 검증했습니다.

설계와 접근

SiO2 기판에 홈 폭 5, 10, 20 μm(간격 비 1)의 감광막 선 패턴을 만들고, 양전하를 띤 3-아미노프로필트리에톡시실레인(APTES) 단분자막을 형성한 뒤 음전하를 띤 GO를 정전기적으로 부착했습니다. 열처리와 감광막 제거 후 GO 선의 양쪽 가장자리에는 능선이, 그 사이에는 거친 GO 표면이 남습니다. 이렇게 만든 GO 기반 패턴 기판(GPS)은 세포의 신장 방향을 안내하는 마이크로 홈, 평균 높이 179 ± 19 nm의 능선, 인테그린 접촉 지점을 제공하는 나노 거칠기의 세 가지 크기 척도를 함께 가집니다. 패턴 없는 GO 코팅 기판(GS)의 표면 거칠기는 제곱평균제곱근 값 3.86 nm였습니다.

평가 방법

사람 태아 뇌에서 유래한 hNSC를 피브로넥틴으로 코팅한 평탄 SiO2(FS), GS, GPS 위에서 염기성 섬유아세포 성장인자와 백혈병 억제인자 없이 배양해 자발적 분화를 유도했습니다. 5일 후 면역염색, 정량 실시간 PCR, 웨스턴 블롯으로 인테그린 군집, F-액틴 정렬, 초점접착 단백질을 평가하고, 면역염색과 PCR로 신경세포·성상세포 표지자를 분석했습니다. 기전은 β1 인테그린 항체와 미오신 II(블레비스타틴), ROCK(Y27632), MEK-ERK(U0126) 억제제로 확인했으며, 전기생리 기능은 테트로도톡신(TTX)을 병용한 전세포 패치클램프로 측정했습니다.

연구 내용과 주요 결과

GO의 나노 거칠기만으로도 FS보다 β1 인테그린 군집이 증가했고, 홈 폭 5 μm GPS에서 모든 기판 중 가장 넓은 군집이 관찰되었습니다. F-액틴은 FS와 GS에서는 무작위로 뻗었지만 GPS에서는 홈과 능선을 따라 정렬되었습니다. 빈큘린, 팍실린, FAK 유전자 발현은 5 μm GPS에서 가장 높았고, 같은 기판에서 FAK(Y397)와 팍실린(Y118)의 인산화가 증가했습니다.

신경세포 유전자(Tuj1, MAP2) 발현은 FS, GS, 홈 폭 10·20 μm GPS보다 5 μm GPS에서 가장 높았으며, GFAP와 네스틴 발현은 군 간에 유의한 차이가 없었습니다. 5 μm GPS에서는 Tuj1 양성 세포 비율이 증가하고 GFAP 양성 세포 비율이 감소했으며, 신경돌기 형성도 가장 활발했습니다.

β1 인테그린 차단, 미오신 II 또는 ROCK 억제는 GPS 위 세포의 정렬을 방해하고 초점접착과 신경 분화를 감소시켰으며, U0126은 신경 계통 세포의 증가를 완전히 되돌렸습니다. 이 처리들은 미토콘드리아 대사 활성을 유의하게 바꾸지 않았습니다. 피브로넥틴 흡착량은 GO 기판에서 FS보다 많았지만(p < 0.05) GS와 5 μm GPS 사이에는 차이가 없어, 저자들은 GPS의 추가 효과가 주로 계층적 표면 지형에 기인할 수 있다고 보았습니다.

5 μm GPS에서 분화한 세포는 전압 의존성 나트륨 전류와 활동전위를 보였고, 0.5 μM TTX 처리 후 모두 사라졌습니다. 군당 8~10개 세포를 분석한 결과 나트륨 전류를 보인 세포의 비율은 5 μm GPS 37.5%, GS 25.0%, FS 10%였습니다.

남은 과제

저자들은 GO가 단백질 흡착, 표면 특성 변화, 그래핀 고유의 전기적 효과를 통해 분화에 영향을 줄 수 있으며, 이러한 기여를 향후 연구에서 규명할 필요가 있다고 밝혔습니다.

다른 연구와의 연결

Park 등은 그래핀 위에서 hNSC의 신경 분화가 증가함을 보고했으며, 이 연구는 GO에 마이크로·나노 크기의 지형을 더하고 그 결과를 인테그린, FAK, ROCK, MEK-ERK 신호와 연결했습니다.