Immune‐Responsive Bioinks Enable Vision‐Guided in Situ Robotic Bioprinting to Accelerate Diabetic Wound Healing

연구 배경

당뇨성 만성 상처에서는 저산소, 혈관신생 저하, 그리고 염증성 M1 대식세포가 재생성 M2 상태로 전환되지 못하는 현상이 함께 나타납니다. 과산화칼슘(CaO2) 기반 산소 방출 소재는 국소 저산소를 완화할 수 있지만 초기 급속 방출, 활성산소종(ROS)의 무분별한 생성, 불규칙한 상처 형상에 대한 낮은 적합성이 한계로 지적되어 왔습니다. hMSC는 재생 인자를 분비하는 세포 치료제로 쓰이지만 주입 시 상처 내 잔류율이 낮고 허혈 조직에서 생존이 어렵습니다. 또한 기존 상처 패치는 대부분 미리 제작된 형태여서 상처마다 다른 형상에 맞추기 어렵습니다.

설계와 접근

CaO2 나노입자를 소수성 식물 단백질인 제인으로 반용매 침전법으로 감싸고 Pluronic F-127로 코팅해 제인 기반 산소 발생 미세입자(zOMP)를 만들었습니다. 제인 껍질은 입자 내부로의 물 침투를 늦춰 산소 발생을 지연시키기 위한 것입니다. zOMP는 폴리에틸렌옥사이드와의 수중-수중 에멀전으로 만든 GelMA/젤라틴 콜로이드 입자에 내포하지 않고 혼합하며, 입자 표면 사이의 수소결합으로 전단담화 특성을 갖는 광가교형 바이오잉크(Coll-zOMP)가 됩니다. 여기에 hMSC를 넣은 것이 Coll-zOMP-hMSC입니다. 출력은 6자유도 로봇팔, 자동 상처 인식, 점군 기반 경로 생성, 실시간 영상 피드백을 결합한 INSIGHT(Intelligent in situ bioprinting Guided by Eye-in-Hand robot Technology)가 담당하며, 제인에서 유래한 노란색이 카메라의 층별 인식을 돕습니다.

평가 방법

하이드로젤은 동적광산란, SEM, AFM 나노압입, 유변 특성, 팽윤, 콜라게나아제 분해, 산소·H2O2 측정으로 분석했습니다. 출력 특성은 온도·전단속도별 점도, 5–15 psi와 22G·30G 노즐 조건의 매달린 필라멘트 시험, 별 모양 표적에 대한 다층 출력으로 평가했습니다. 체외에서는 인간 진피 섬유아세포(HDF), hMSC, 각질형성세포, HUVEC를 Coll, Coll-zMP(CaO2 없는 제인 입자), Coll-zOMP, 카탈라아제 첨가군과 함께 정상산소, 저산소(약 1% O2), 무산소(< 0.1% O2) 조건에서 배양했고, THP-1 단핵구와 hMSC 함유 바이오잉크를 공배양해 사이토카인 어레이와 RT-qPCR을 수행했습니다. 생체에서는 수컷 db/db 생쥐의 직경 6 mm 전층 상처에 바이오잉크를 출력하고 10일 동안 Tegaderm과 비교해 상처 봉합, 조직학, 면역염색, RT-qPCR, 공간전사체를 분석했습니다.

연구 내용과 주요 결과

zOMP의 유체역학적 직경은 198.2 ± 10.5 nm였습니다. Coll-zOMP 하이드로젤은 Coll보다 공극 분율이 낮았고, 평균 표면 거칠기에는 유의한 차이 없이 AFM 나노압입으로 측정한 DMT 탄성률이 높았으며, UV 광원 거리를 0 cm에서 8 cm로 늘려도 경화 높이가 거의 일정했습니다. 출력된 Coll-zOMP는 처음 23분 동안 약 90 μmol/L의 초기 방출 후 1일째 약 20 μmol/L, 3일째 약 5 μmol/L(약 1.98% O2)의 산소를 유지했고, H2O2는 7일 동안 낮은 비세포독성 범위에 머물렀습니다.

두 바이오잉크 모두 전단담화 특성을 보였고 0 °C부터 약 30 °C까지 점도가 안정적이었습니다. Coll-zOMP는 5–15 psi 전 범위에서 Coll보다 긴 매달린 필라멘트를 형성했고, 22G와 30G 노즐 모두에서 약 40 mm의 필라멘트 길이를 유지했습니다. INSIGHT는 원, 다각형, 거미줄 패턴과 7층 나선 구조를 출력했으며, 별 모양 표적에서 스캔과 출력을 반복할 때 한 번의 출력 주기마다 높이가 약 1 mm씩 증가했습니다.

출력된 hMSC는 < 0.1% O2에서 24시간 후에도 높은 생존율을 보였습니다. 산소 결핍 조건에서 12시간 HDF 이동률은 Coll-zOMP에서 약 60%, Coll에서 약 20%였고, 각질형성세포 집락은 Coll이나 Coll-zMP보다 크고 많았습니다. HUVEC 이동 실험에서는 카탈라아제를 넣어도 산소 발생 입자의 효과가 유지되어, 저자들은 H2O2보다 산소 공급이 주된 기여 요인이라고 해석했습니다. THP-1 공배양에서 Coll-zOMP-hMSC는 Coll-zMP-hMSC보다 IL-6 분비를 낮추고 IL10 발현을 높였습니다.

db/db 생쥐에서 Coll-zOMP-hMSC를 출력한 상처는 3일과 10일 모두 Tegaderm보다 유의하게 빨리 봉합되었고, 이동 중인 과증식 표피 면적, 호중구, CD11b+TNF-α+ 세포가 적고 CD11b+CD206+ 세포와 Fn1·Vegfa·Arg1 발현이 많았습니다. HIF-1α 양성 면적은 Tegaderm 약 6.0%에서 Coll 9.9%, Coll-zOMP 11.3%, Coll-zOMP-hMSC 15.7%로 증가했습니다. 공간전사체 분석에서 이동 표피가 차지하는 비율은 Coll-zOMP-hMSC 62.5%, Coll 32.0%였고, 유의한 신호 경로 수는 21개에서 34개로 늘었으며, M1에서 M2로 향하는 의사시간 궤적과 함께 Il4·Egf·Grn 신호가 특이적으로 증가했습니다.

남은 과제

저자들은 출력물과 상처의 계면 접촉이 조직 접착력 측정이 아니라 형상 적합성에 근거한 것이라고 밝히고, 랩 전단 또는 박리 시험을 후속 과제로 제시했습니다. 대식세포 재프로그래밍의 인과성을 확인하려면 계통 추적이나 대식세포 선택적 제거 실험이 필요하며, 임상 적용을 위해서는 바이오잉크의 장기 기능, 대량 제조와 보관 안정성, 대동물 검증, AI 기반 맞춤형 바이오프린팅의 규제·안전성 검토가 남아 있다고 정리했습니다.

다른 연구와의 연결

이전의 현장 출력 지지체는 빛을 받은 미세조류가 산소를 생산하는 방식이었던 반면, 이 바이오잉크는 제인으로 감싼 CaO2에서 화학적으로 산소를 공급하고 hMSC의 측분비 신호를 더하며, 로봇이 상처를 인식한 뒤 출력합니다.