Electroconductive nanoscale topography for enhanced neuronal differentiation and electrophysiological maturation of human neural stem cells

연구 배경

나노·마이크로 크기의 표면 지형은 접촉 유도, 인테그린 결합, 국소 부착 신호를 통해 줄기세포 분화를 유도할 수 있습니다. 그러나 저자들은 단순한 지형 신호만으로는 줄기세포에서 유래한 신경세포의 기능적 성숙을 이끌기 어려운 경우가 많다고 지적합니다. 전도성 고분자, 탄소나노튜브, 금속 증착층을 통한 전기 신호도 신경돌기 성장과 신경 분화를 촉진합니다. 이 연구는 정해진 나노 지형과 전도성을 함께 갖추고 전류도 흘릴 수 있는 하나의 기판이, 신경영양인자 없이 hNSC의 신경 분화와 전기생리학적 성숙을 촉진하는지 확인하고자 했습니다.

설계와 접근

모세관력 리소그래피(CFL)로 PUA에 홈·돌기 나노패턴을 성형하고, 전기전도성과 생체적합성을 고려해 전자빔 증착으로 Ti를 30 nm 코팅했습니다. 이렇게 만든 Ti 코팅 나노패턴 기판(TNS)은 접촉 유도를 위한 홈과 전도성 표면을 함께 제공합니다. 능동 자극 시에는 TNS 양 끝에 고정한 전선으로 격자 축과 평행한 방향의 펄스 전류를 가합니다. 세포를 심기 전 기판에는 피브로넥틴(FN)을 코팅했습니다.

평가 방법

임신 13주 인간 태아 종뇌 조직에서 분리한 hNSC를 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)와 백혈병 억제인자(LIF) 없이 평판·나노패턴 PUA(FS, NS), Ti 코팅 평판(TFS), TNS에서 배양했습니다. 5일 또는 12일 시점에 Tuj1, MAP2, NeuN, GFAP와 신경세포 아형 표지자의 면역염색과 정량 PCR(qPCR)로 신경·성상세포 분화를 평가했습니다. 기계신호 전달은 빈쿨린·F-액틴 염색, 국소부착인산화효소(FAK) 인산화, β1 인테그린·미오신 II·Rho 연관 단백질 인산화효소(ROCK)·MEK1/2 억제 실험으로, 기능은 5일 뒤 전세포 패치 클램프로 평가했습니다. 펄스 자극(1 Hz, 하루 두 번 30분, 전류·전압 상한 3 µA·25 V)은 세포를 심고 1일 뒤부터 TFS와 TNS에 가했습니다(ETFS, ETNS). 모든 실험은 체외에서 수행했습니다.

연구 내용과 주요 결과

원자힘현미경과 주사전자현미경으로 홈·돌기 폭 150, 200, 250, 300 nm, 패턴 높이 300 nm를 확인했으며, Ti 층은 지형을 크게 바꾸지 않고 홈을 덮었습니다. 초록에는 홈 두께가 150 μm로 적혀 있어 결과 절과 다릅니다. 150 nm TNS의 전기전도도는 코팅 전 1250 ± 68 S cm−1, FN 코팅 후 916 ± 23 S cm−1였고, Ti를 입히지 않은 PUA의 전도도는 0이었습니다.

전류를 가하지 않아도 150, 200 nm 홈의 TNS에서는 TFS보다 Tuj1 양성 세포가 늘고 GFAP 양성 세포가 줄었습니다. 12일 뒤 NeuN 양성 세포는 150 nm TNS에서 86.2 ± 1.5%로 TFS의 72.6 ± 3.1%보다 많았고, Tuj1 발현은 같은 형상의 비코팅 나노패턴보다 TNS에서 4배 높았으며 GFAP는 유의한 차이가 없었습니다. 결과 절에서 TNS는 분화를 글루탐산성보다 GABA성·도파민성 계열로 이끌었고, 12일 뒤 GAD67과 TH 발현은 높고 GluT 발현은 낮았습니다. 반면 초록에는 도파민성과 글루탐산성 신경세포 분화가 촉진되었다고 적혀 있습니다. TNS의 신경세포 유사 세포는 테트로도톡신(TTX) 처리로 사라지는 나트륨 전류와 활동전위를 보였고, 나트륨 전류를 내는 세포 비율은 TNS 19.6%, TFS 13.9%였으며 평균 전류 크기 차이는 통계적으로 유의하지 않았습니다.

빈쿨린과 FAK 발현은 FS·TFS보다 NS·TNS에서 높아, 저자들은 국소 부착 형성에 전도성보다 나노 지형이 더 중요할 수 있다고 해석했으며, FAK 인산화도 TFS보다 TNS에서 높았습니다. β1 인테그린 차단은 TNS에서 국소 부착 조립을 억제했고, Y27632에 의한 ROCK 억제와 블레비스타틴에 의한 미오신 II 억제는 F-액틴 정렬을 흩뜨리고 분화 표지자를 낮췄으며, U0126에 의한 MEK-ERK 억제는 TNS의 신경 분화 촉진 효과를 완전히 되돌렸습니다. 억제 실험의 분화 판독(Tuj1 발현)은 약 1일 시점에 이루어졌으며, 5일 시점에는 Y27632가 TFS에서 Tuj1과 MAP2 발현을 높였습니다.

5일 뒤 MAP2 양성 세포는 FS 24.6 ± 2.0%, NS 37.1 ± 2.1%, TFS 40.6 ± 0.7%, TNS 48.4 ± 2.1%, ETFS 48.9 ± 2.6%, ETNS 56.2 ± 1.3%였고, ETNS는 FS보다 Tuj1과 MAP2 발현을 2~2.5배 높였습니다. 전기자극은 GFAP를 높이지 않았고 Nestin, Oct4, Nanog 발현도 바꾸지 않았습니다. 자극 효과는 TNS보다 TFS에서 컸으며, ETFS와 ETNS 사이의 Tuj1·MAP2 발현에는 유의한 차이가 없었습니다. ETNS에서는 전압의존성 이온채널 CACNA1C와 SCN1α 발현이 늘고, 칼슘 영상에서 자극 중 칼슘 유입과 탈분극이 관찰되었으며, ERK1/2 인산화가 증가했습니다. 저자들은 자극이 전압의존성 이온채널과 ERK1/2 신호를 거쳐 작용한다고 추정합니다.

남은 과제

저자들은 격자 홈의 깊이가 분화에 미치는 영향을 조사하지 않았고, 억제 실험을 이른 시점에 판독했다고 밝혔습니다. 또한 전기자극의 장기 효과와 분화 촉진 기전은 추가 연구가 필요하며, 신경세포 유사 세포를 더 많이 공급하려면 나노 제작 기술과 재현성을 개선해 시스템을 확장해야 한다고 적었습니다.

다른 연구와의 연결

관련 그래핀 연구는 전도성 2차원 탄소 소재 위에서 hNSC의 부착과 신경 분화를 살폈고, 이 연구는 정해진 나노격자와 얇은 Ti 코팅을 결합한 뒤 그 코팅으로 펄스 전류를 흘려 지형, 전도성, 전기자극의 효과를 나누어 비교했습니다.