Triboelectric Nanogenerator Accelerates Highly Efficient Nonviral Direct Conversion and In Vivo Reprogramming of Fibroblasts to Functional Neuronal Cells

연구 배경

계통 특이적 전사인자로 체세포를 신경세포로 직접 전환하면 배아나 만능줄기세포 단계를 거치지 않아도 되지만, 전사인자 전달에 흔히 쓰는 바이러스 벡터는 면역원성과 종양원성 문제가 있습니다. 비바이러스 고분자 나노입자로 생쥐 섬유아세포를 iN 세포로 전환한 보고도 있었으나 효율이 낮았습니다. 저자들은 외부 전기 자극으로 비바이러스 전달의 낮은 효율을 보완할 수 있는지 검토했습니다.

설계와 접근

TES는 알루미늄 상판과, 캡톤과 구리 전극 위에 붙인 두께 약 300 µm의 마이크로 기둥 구조 폴리디메틸실록산(PDMS) 하판이 주기적으로 접촉·분리되면서 양방향 펄스 전류를 만듭니다. 접촉 시 전자가 알루미늄에서 PDMS로 이동하고, 분리와 재접촉 때마다 외부 회로에 반대 방향의 전류가 흐릅니다. TES를 티타늄 코팅 실리콘 배양 기판과 직렬로 연결해 세포가 자극 전극 위에서 자라도록 했습니다. Brn2, Ascl1, Myt1l(BAM) 유전자는 생쥐 배아 섬유아세포(PMEF)에 전기천공법으로 전달하고, 파종 2일 후 지름 100~150 nm의 생분해성 폴리(β-아미노 에스터)(PBAE) 나노입자로 한 번 더 전달했습니다.

평가 방법

평판형과 마이크로 기둥 구조 PDMS의 출력, 0.5~3 Hz 접촉 주파수에서의 출력, 축전기 충전과 반복 구동 안정성을 측정했습니다. 형질감염한 PMEF를 1 Hz TES에 하루 60분씩 노출하고, 무처리(NT)군, TES 단독군, BAM 단독군과 Tuj1·MAP2 염색, 정량 PCR, 신경돌기 길이, RNA 시퀀싱, 전세포 패치클램프, 칼슘 영상, 인산화 ERK1/2 웨스턴 블롯으로 비교했습니다. 생체 내 실험에서는 BAM 플라스미드를 담은 PBAE 나노입자를 생쥐 피내에 0일과 2일에 주사하고, 2 cm 간격의 심전도 패치를 통해 하루 30분씩 14일 동안 자극했습니다.

연구 내용과 주요 결과

마이크로 기둥 구조 PDMS를 쓴 TES는 개방 전압 약 30 V, 단락 전류 약 280 nA를 내 평판형 PDMS의 약 10 V, 110 nA보다 높았습니다. 정류한 출력으로 22 µF 축전기를 충전해 청색 LED를 켰고, 반복 구동에서도 양방향 출력의 뚜렷한 저하는 없었습니다.

TES는 전환을 앞당기고 효율을 높였습니다. 9일째 Tuj1 양성 세포 비율은 BAM/TES군 8.85%, BAM군 0.13%였고, 12~14일째에는 각각 14.17%와 6.41%였습니다. TES 단독군은 0.22%였습니다. 12일째 Tuj1과 MAP2 발현은 BAM군보다 1.5~2배 높았으며, 7일 배양한 세포에서는 280 nA 자극이 110 nA 자극보다 Tuj1과 MAP2 발현을 더 높였습니다. 저자들은 TES가 Tuj1 양성 iN 세포를 얻는 기간을 3~5일 단축했으며, 비바이러스 전달로 보고된 Tuj1 양성 iN 세포 효율 중 저자들이 아는 범위에서 가장 높다고 밝혔습니다.

TES는 iN 세포의 성숙도 앞당겼습니다. 14일째 BAM군에는 MAP2 양성 세포가 없었지만 BAM/TES군에는 일부 있었고, 16~18일째 Tuj1 양성 세포 중 MAP2 양성 비율은 TES 적용 시 61.2%, 미적용 시 31.3%였습니다. BAM/TES군의 평균 신경돌기 길이는 0.17 mm였고, 18일째에는 약 2.9 mm에 이르는 신경돌기도 관찰되었습니다. 30일째에는 NeuN과 시냅신 I이 점상으로 염색되었고 vGlut1과 GAD67 양성 반응을 보였습니다. RNA 시퀀싱에서는 PMEF 대비 2배 넘게 변한 유전자 859개(P < 0.05)가 확인되었으며, 섬유아세포 유전자는 억제되고 신경·시냅스 유전자는 증가했습니다. 이 세포는 활동전위와 나트륨 전류를 보였고 0.5 × 10−6 M 테트로도톡신 처리 후 사라졌으며, 글루탐산 처리 시 세포 내 칼슘이 증가했습니다.

자극 중 세포 내 칼슘은 9일째와 12일째 모두 지속적으로 증가했고, 7일째 BAM/TES군에서 ERK1/2 인산화가 증가해, 저자들은 칼슘 채널 활성화, 칼슘 유입, ERK1/2 신호로 이어지는 경로를 추론했습니다. 생쥐 피부에서 1 Hz 자극 시 측정된 전류는 약 80 nA였으며, BAM과 TES를 병용하면 주로 진피에서 5.86%의 효율로 Tuj1 양성 세포가 생겨 BAM 단독의 0.04%보다 높았습니다.

남은 과제

저자들은 전기 자극이 신경 분화를 높이는 분자 기전이 아직 충분히 밝혀지지 않았다고 밝혔으며, TES 주파수가 전압 개폐 칼슘 채널을 조절할 것이라는 설명은 기존 보고에 근거한 가정으로 제시했습니다. 다음 단계로는 호흡과 심장 박동에서 에너지를 얻는 TES 패치 개발을 제시했습니다.

다른 연구와의 연결

Vierbuchen 등의 정의된 인자 기반 전환 연구는 Ascl1, Brn2, Myt1l 세 가지 인자로 생쥐 섬유아세포를 기능성 신경세포로 전환했으며, 이 연구는 같은 인자를 비바이러스 방식으로 전달하고 마찰전기 자극으로 효율을 높였습니다.