Full length histone H3 conjugated electrochemical biosensor for extracellular proteolytic Cathepsin L activity detection

연구 배경

CTSL은 여러 암에서 과발현되는 시스테인 단백질분해효소이며, 리소좀형보다 활성이 10배 높다고 알려진 세포 밖 CTSL은 전이 과정의 기질 분해에 관여합니다. 항체 기반 분석은 CTSL의 활성이 아니라 양을 측정하고, 형광 기질법은 검출 한계가 확립되지 않았으며 높은 세포 밀도를 요구하고, 광친화 탐침은 빛에 약한 표지에 의존합니다. 효소 활성을 측정한 기존 FET는 기질을 FET 자체에 결합해 소자당 측정 횟수가 제한되었습니다.

설계와 접근

136개 아미노산으로 된 기질인 BFLH3를 (3-아미노프로필)트리에톡시실란과 글루타르알데하이드로 처리한 인듐 주석 산화물(ITO) 확장 게이트(EG)에 스트렙트아비딘-바이오틴 결합으로 고정합니다. EG에는 네 개의 웰을 가진 폴리디메틸실록산(PDMS) 블록이 붙어 있으며, 이중 게이트 SOI FET의 상부 게이트에 연결됩니다. CTSL은 BFLH3를 주로 21번째 아미노산 뒤에서 자르는데, 바이오틴이 N 말단에 있어 16.3 kDa 단백질 중 큰 쪽인 12.97 kDa 부분이 떨어져 나갑니다. pH 7에서 떨어져 나가는 전하는 서론과 FET 특성 평가 절에서 +13.2, FET와 형광법을 비교한 절에서 +13.4로 적혀 있습니다. 이로 인한 EG 표면 전하 변화를 후면 게이트 전압 스윕의 이동으로 읽으며, EG를 교체할 수 있어 FET 하나로 여러 번 측정할 수 있습니다.

평가 방법

상부 게이트 전압 단계와 pH 4, 7, 10 완충액에서 드레인 전류로 FET를 평가하고, 원자힘현미경과 비신코닌산(BCA) 분석으로 BFLH3 결합을 확인했습니다. 사람 간 유래 CTSL을 CTSL 완충액에서 0.1 ng/mL~10 μg/mL 범위로 시험하고, 형광 기질 magic red-FRFR(MR-FRFR)을 플레이트 분석과 EG 코팅 양쪽에서 비교했습니다. 96웰 플레이트에서 웰당 10^4개로 배양한 LNCaP(전립선 선암 전이 병변 유래)와 PANC-1(췌장암, 음성 대조) 세포의 배양액을, RPMI 1640과 DMEM을 기준으로 자기 정규화하고 0.5 및 5 ng/mL CTSL을 첨가한 같은 배지로 정량하여 측정하고, 세포 용해물의 ELISA·웨스턴 블롯 결과와 비교했습니다.

연구 내용과 주요 결과

상부 게이트 전압을 1 V에서 5 V로 높이면 드레인 전류가 약 두 자릿수 증가했고, 소자의 pH 감도는 173.33 mV pH−1로 네른스트 한계 59.6 mV pH−1보다 높았습니다. 스트렙트아비딘과 BFLH3 결합 후 EG의 제곱평균 거칠기는 6.184 nm에서 4.323 nm, 3.786 nm로 줄었고, 중앙 높이는 4.435 nm에서 6.331 nm, 9.104 nm로 높아졌습니다. BCA 흡광도는 웰당 10^13 분자(cm2당 2.8 × 10^13 분자, BFLH3 1.12 mg/mL에 해당)에서 포화되었고, 이후 실험에는 이 결합량을 사용했습니다.

CTSL 완충액에서 FET의 검출 한계는 1 ng/mL로, MR-FRFR 형광법의 10 μg/mL보다 낮았고 ELISA에 대해 알려진 1.7 ng/mL와 비슷했습니다. 저자들은 시험한 암세포 대부분의 용해물에 CTSL이 3.34~12.80 ng/mL 들어 있다고 밝혔습니다. 100 ng/mL CTSL에서 MR-FRFR을 코팅한 EG는 완충액과 유의한 차이가 없었는데, 저자들은 떨어져 나가는 형광체가 0.34 kDa, +1로 작기 때문으로 설명했습니다. 반면 BFLH3 코팅 EG는 30분 후 0.25 V 이동해 완충액의 0.01 V와 구분되었습니다.

배양액에서 전압 이동은 RPMI 1640의 1.50 V에서 LNCaP 배양액의 0.23 V로, DMEM의 1.05 V에서 PANC-1 배양액의 0.55 V로 줄었으며, 50 mM HEPES 완충으로 pH 변동을 7.2~7.6(69.33 mV 해당)으로 제한했습니다. CTSL 첨가 배양액으로 보정한 결과 세포 밖 CTSL은 LNCaP 7.29 ng, PANC-1 2.44 ng이었고, 세포 용해물의 ELISA 값은 각각 10.45 ng, 5.52 ng이었습니다. FET는 웰당 10^4개 세포의 배양액에서 CTSL을 정량해 형광법의 세포 검출 한계(웰당 10^5개)보다 낮았으며, 웨스턴 블롯과 ELISA 모두 LNCaP의 CTSL이 PANC-1보다 약 2배 많음을 보였습니다.

남은 과제

저자들은 EG를 교체할 때 FET에 고유한 불안정성이 있어 각 조건을 EG 하나의 네 챔버에서 측정했다고 밝혔습니다. 배양액 실험은 두 가지 배양 세포주에서의 개념 증명으로 제시되었고, FET는 세포 밖 CTSL을, ELISA와 웨스턴 블롯은 세포 용해물 전체를 측정한다는 차이가 있습니다.

다른 연구와의 연결

타액 인터루킨 8을 검출한 실리콘 나노와이어 센서처럼 항체를 붙인 FET는 표적 단백질이 얼마나 결합했는지를 읽는 반면, 이 연구에서 측정하는 양은 효소 활성입니다. CTSL이 고정된 기질을 자르고, 전하를 띤 조각이 떨어져 나가면서 게이트 전위가 바뀝니다.